sobota, srpna 27, 2005

Mechanismus chránící bílkoviny extremofilních organismů- disulfidické můstky

Trocha systematiky

Až do 50.let 20.století bylo většinou biologů uznáváno třídění organismů do dvou skupin:rostliny a živočiši.Ale v 50. a 60. letech toto rozdělení selhávalo při snaze začlenit bakterie,prvoky a houby a v 70. letech byl tedy přijat systém 5 říší: bakterie(prokaryota) a 4 říše v rámci eukaryot: houby, rostliny, živočiši, prvoci.


Na konci 70. let však byla v rámci bakterií objevena ještě jedna skupina organismů,které se značně lišily životním stylem(produkovaly methan,žily v extrémních podmínkách) ale hlavně s odlišným geonomem(jakkoliv pod mikroskopem vypadají velmi podobně).A daly vznik 3. samostatné skupině na úrovni eukaryot nebo eubakterií (bakterií v původním smyslu):archebakterií(v současnosti správné pojmenování:archae ,protože opravdu mají s bakteriemi velmi málo společného,tudíž aby název nemátl).


Mezi archae patří organismy jejichž pro růst optimální podmínky jsou extrémní:vysoké teploty(i přez 100°C),nízké pH(kyselé prostředí:acidofilní organismy),vysoké pH(zásadité prostředí:basofilní organismy),vysoká koncentrace solí(halofilní).Napodobit tyto podmínky v laboratoři za účelem kultivace a pozorování je náročné,a tudíž základní poznatky,jako třeba mechanismus kterým se archae brání před denaturací svých bílkovin v tak extrémních prostředích byly jen předpokládané.

(denaturace není poškození primární struktury bílkoviny,tedy pořadí aminokyselin,nýbrž až prostorové struktury,kdy je bílkovina,konformovaná neboli zabalená v jednu z několika možných struktur převedena ze své struktury plnící specifickou funkci v organismu do jiné,nefunkční,struktury).


Mechanismy obrany před extrémními teplotami

Značná podobnost primární struktury(pořadí aminokyselin) bílkovin u teplotně odolných i neodolných organismů nasvědčovala ,že klíč k stabilitě bílkovin bude spočívat v jejich nekovalentních vazbách(řádově mnohem slabších než klasická chemická vazba) -interakcích bočních řetězců aminokyselin které jsou různě nabité, hydrofobní či hydrofilní(přičemž hydrofilní se navzájem přitahují a hydrofobní se navzájem přitahují a hydrofilní s hydrofobními se odpuzují). Dle článku uveřejněného 23.8. na PloS Biology se silně uplatňuje ještě další mechanismus:disulfidické můstky(tedy typem již kovalentní vazby).


Disulfidický můstek (DM) je tvořen vazbou bočních řetězců dvou cysteinů (jedna z 20 základních stavebních aminokyselin ,obsahuje jako jediná skupinu –SH v bočním řetězci,tyto skupiny různých cysteinů se mohou spojit za vzniku disulfidické vazby -S-S- která tak fixuje prostorovou strukturu bílkoviny,tím že omezí možnosti vzájemného pohybu tímto můstkem spojených částí bílkoviny)


Úloha disulfidických můstků ve stabilizaci bílkovin termofilních organismů

V této studii bylo zkoumáno 199 organismů, nejen archeí ale i bakterií.Dle klasického názoru se DM běžně podílejí na stabilizaci extracelulárních( a v organelách obsažených) bílkovin.Velký význam se jim nepřisuzoval v cytosolu(cytoplasma bez organel) kde panuje redukční prostředí a jelikož cystein má vytvořené disulfidické můstky v oxidovaném stavu a v redukovaném stavu má volné –SH skupiny - v redukčním prostředí jsou DM nestabilní.


Předpokládalo se že ,je-li úloha DM při stabilizaci významná,budou ty nejteplomilnější ze zkoumaných prokaryot mít také nejvíce DM-bylo tedy třeba zjistit kolik mají zkoumané prokaryoty DM a vytvořit nějakou objektivní stupnici.

Jak zjistit strukturální informace o bílkovinách

Primární struktury bílkovin zkoumaných prokaryot byly vzaty z Databáze geonomu prokaryot ,přičemž následně všem těmto bílkovinám se známou pouze primární strukturou byl softwarem přiřazen typ bílkoviny s homologní strukturou a známou trojrozměrnou strukturou(tedy šlo o aproximaci na základě podobných prostorových vlastností mezi různými aminokyselinami, skupinami aminokyselin etc) a tak byla odhadnuta 3D struktura proteinu zkoumaného organismu pouze na základě jeho jednorozměrné struktury:pořadí aminokyselin.Jako DM byly brány všechny místa,kde se dva cysteiny nacházely blízko sebe.


Za prostorově blízko se nacházející aminokyseliny byly označeny ty,jejichž alfa uhlíkyuhlík,na který je vázána –COOH a –NH2 skupina byly blíže než 8 angströmů (1 angström = 10-10 m=0,1nm ) a byly odděleny více než 4 aminokyselinami v primární struktuře bílkoviny.


(z výpočtů byly vyňaty bílkoviny,které mohly vázat kovy,protože dva cysteiny poblíž sebe můžou být také kov vážící a tedy v těchto případech netvoří zpevňující disulfidický můstek; dále byly vyňaty také extracelulární bílkoviny)


Poté se analyzovala tendence aminokyselin (odchylka od předpokládaného statistického stavu kdy by se každá aminokyselina s každou vázala stejně často) nacházet se (prostorově) blízko všech dalších typů aminokyselin(tedy 400 kombinací).


Logaritmicky (o základu 10) vzatý poměr skutečně zjištěného výskytu DM ku počtu DM , které by vznikly kdyby se cystein pravidelně náhodně nacházel poblíž dalším 19 aminokyselinám a ne soustředěn do DM, byl vzat jako stupnice.Takže například,byl-li výskyt DM u bílkovin organismu 10krát častější než by odpovídalo jen náhodnému rozložení cysteinů,bylo toto označeno na stupnici jako 1,byl li výskyt desetkrát míň častý,bylo toto označeno jako -1.


Výsledek dle předpokladů
(ad obrázek:uvedny jendopísmenné zkratky aminokyselin)

S málo výjimkami se ukázala tendence blízkosti cysteinů jako dominantní ze všech ostatních 20 případů(blízkosti cysteinu k jedné z dalších dvaceti aminokyselin).Ovšem také blízkost tryptofan-tryptofan(v tabulce nezobrazeno) byl ještě ze všech 400 možných kombinací u některých podmnožin analyzovaných prokaryot častý(zde jsou předpokládány nekovalentní vazby typu “aromatic clustering“.


(Výpočet na základě čtyř, na DM nejbohatších organismů ,říká že 35,6% cysteinů je obsaženych v DM )

Pyrobaculum aerophilum,který byl předmětem i jiných studií,ukázal ,dle předpokladu, častost výskytu cystein-cystein 10krát větší než by odpovídalo náhodnému rozložení,tedy hodnota 1 na stupnic.


Zajímavé je že ne všechny termofilní organismy obsahovaly hojnost disulfidických můstků,hlavně ty metanogenní a síru redukující tedy typ organismů,které žijí v silně redukčním prostředí což zamezilo využití disulfidických můstků.


Krom termofilů mají i některé jiné organismy jako třeba halofilní,alkalofilní,acidofilní a k radiaci tolerantní ,znatelně zvýšený stupeň DM-z čehož plyne že DM slouží obecně k stabilizaci bílkovin v různých extrémních prostředích.


V dřívějších výzkumech byly hledány bílkoviny charakteristické pro všechny termofily,ovšem tato studie se zaměřila na hledání proteinů charakteristických pro termofily využívající hojnost intracelulárních disulfidických můstků.Malá podmnožina bílkovin byla identifikována jako unikátní pro tyto organismy,ale jediný protein souhlasil perfektně(z rodiny proteinů kam patří např PDO). PDO(protein disulfide oxidoreductase) bílkovina z Py.furiosus byla již strukturálně analyzována a bylo dokázáno že se může chovat jako disulfid oxidasa,reduktasa nebo isomerasa in vitro.Pravděpodobně bude tato bílkovina klíčová při tvorbě a udržování DM i v prostředí cytosolu.

(Z celého tohoto výzkumu mimo jiné plyne,nakolik je prospěšné i zdánlivě bezcílné plošné sekvenování všech organismů a ukládání těchto dat ve volně přístupných databázích)




0 Comments:

Okomentovat

<< Home